l 該試劑盒用于體外定量檢測人 血清、血漿或其他相關(guān)生物液體中MT的濃度。

實驗原理：

本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被有人褪黑素(MT)抗體的微孔中，依次加入樣本、標準品、HRP標記的抗原，中間經(jīng)過溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人褪黑素(MT)呈負相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成：

試劑盒參數(shù)：

需自備的設(shè)備及試劑： 

1. 450±10nm 濾光片酶標儀

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸餾水或去離子水.

5. 脫脂棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準備若干個標準品稀釋管.

樣本處理及要求：

1. 試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實驗前通過相關(guān)文獻預估樣本中待測物的濃度并通過預實驗確定樣本的實際濃度情況。如果樣品中待測物濃度過高或過低，請對樣本做適當?shù)南♂尰驖饪s。

2. 若所檢樣本不在說明書所列樣本之中，建議做預實驗驗證其檢測有效性。

3. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

4. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

5. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

6. 細胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

7. 其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

8. 樣品外觀：樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

9. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

檢測前準備工作：

1. 請提10分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 標準品梯度工作液配制：加入1mL通用稀釋液至凍干標準品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為500pg/mL)，然后按照以下濃度：500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.2pg/mL、 15.6pg/mL、7.8pg/mL、0pg/mL進行稀釋。

倍比稀釋方法：取7支 EP管，每管中加入500μL通用稀釋液,500pg/mL的標準品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成250pg/mL的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再從倒數(shù)第二管中吸取液體，具體如下圖。

3. HRP-抗原工作液配制：使用前15分鐘將濃縮HRP-抗原于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮HRP-抗原稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當日使用。

4. 1×洗滌液配制：取10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可放置室溫，輕搖均勻，待結(jié)

5. 晶溶解后再配置)。

操作步驟：

1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標準品按照50μl每孔加入相應孔中，空白孔加入50μL通用稀釋液，緊接著每孔加入50μL HRP-抗原工作液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時。（建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標板內(nèi)測試，從而減少基質(zhì)效應對測試結(jié)果的誤差影響，最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋倍數(shù)。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設(shè)立復孔）。

3. 洗板：棄去液體，每孔加入300μL 1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板3次（也可用洗板機洗板）。

4. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。

5. 加終止液：每孔加入終止液50μL，立即在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷：

1. 計算標準品和樣本復孔的平均OD值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在雙對數(shù)坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值低于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)據(jù)和參考曲線：

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標準曲線。

注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

試劑盒性能：

1. 重復性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。

2. 回收率：在選取的健康人血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入3個不同濃度水平的人MT，計算回收率

3. 線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人MT，在標準曲線動力學范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性。